肝细胞癌（HCC）是全球癌症相关死亡的主要原因之一，其预后取决于肿瘤的分期。早期HCC患者可通过切除或肝移植等方式进行治疗，其5年生存率>70%，而晚期患者5年生存率<10%，由此可见，早期诊断尤为重要。
目前，HCC筛查普遍认可和使用的生物标志物是血清甲胎蛋白（AFP），然而其敏感性一般（40-60%），尤其是在筛查早期HCC时；且AFP升高还与病毒性肝炎患者的高ALT水平有关。为了改善早期HCC筛查方法，迫切需要开发更好的生物标志物。
近日，由美国Baruch S. Blumberg 研究所Ying-Hsiu Su领衔的研究团队在British Journal of Cancer期刊上发表重要研究成果。该团队开发了一种基于尿液ctDNA生物标记物的检测组，包括突变的TP53，甲基化的RASSF1A和GSTP1，并与AFP联合建立两阶段模型，用于HCC的检测和筛查。
相比单独使用AFP检测，含尿液ctDNA的两阶段模型检测能将检出病例数提高30%，巴塞罗那肝癌分期（BCLC）0期HCC的检出率从62%提高到92%， BCLC A期从40%提高到77%。因此，基于尿液ctDNA的检测对HCC患者，尤其是低AFP患者具有良好的诊断价值，可作为一种潜在的无创性HCC筛查方法。
HCC是一种由多种病因引起的异质性疾病，因此会存在多种基因的改变。前期研究表明，尿液中含有一些低分子量DNA或无细胞DNA；另外HCC等癌症患者尿液中的DNA也具有癌症特异性，如基因突变和异常DNA甲基化等。
为了确定HCC的潜在尿液DNA标记物，研究人员利用来自慢性肝病、肝硬化或HCC患者的已保存尿液DNA，对8种标记物进行检测，发现与非HCC（肝炎+肝硬化）患者相比，HCC患者尿液中249位点突变TP53、甲基化的mRASSF1A和mGSTP1水平显着增高，因此将这3个标记物作为ctDNA检测组用于后续分析。
接下来，研究者开展了一项前瞻性、多中心病例对照式分析，共入组609例患者，包括186例HCC，144例肝硬化和279例乙型肝炎，收集其尿液DNA样本（至少1 ng/mL），并对尿液ctDNA检测组进行定量，以分析其筛查HCC的性能。
首先，研究人员通过构建ROC曲线，分析血清AFP和尿液ctDNA检测组对HCC的筛查性能。结果显示：虽然尿液ctDNA检测组的性能（AUROC为0.7440）不及血清AFP（AUROC为0.8546），但在90%特异性时，血清AFP的诊断临界值为5.8 ng/mL，明显低于普遍接受的AFP值≥20 ng/mL。
考虑到肝硬化和慢性肝炎患者的AFP通常高于5.8 ng/mL，研究人员将AFP <20 ng/ml的患者定义为“低AFP”，进一步分析尿液ctDNA检测组在低AFP患者中的检测性能。
研究人员发现在186例HCC患者中，98例（53%）为低AFP患者，这一比率与以往研究一致[8]。另外，当特异性为90%时，在所有HCC患者中，82例（44.1%）患者尿液ctDNA检测呈阳性；而在低AFP患者中，48例患者尿液ctDNA阳性。该数据表明尿液ctDNA标记物的检测性能独立于血清AFP。
为了更好的从低AFP人群中鉴别HCC患者，研究人员提出以AFP≥20 ng/mL为临界值鉴别HCC的两阶段模型，然后在低AFP的亚群上建立AFP和ctDNA联合的logistic模型。结果显示：两阶段模型AUROC为0.9118，显着高于仅使用AFP的模型；该模型在特异性为90%时，可以从低AFP人群中额外鉴别出60例（60%）HCC患者。
接下来，研究人员按肿瘤分期（BCLC分期），进一步分析了AFP、尿液ctDNA和两阶段模型在肿瘤不同分期中的总体表现性能。
结果显示：以AFP≥20 ng/mL为临界值，仅使用AFP对BCLC分期0、A、B、C和D期患者检测的敏感性分别为62%、40%、57%、52%和29%；当尿液ctDNA检测特异性为90%时，结果分别为23%、49%、39%、43%和71%；而两阶段模型的敏感性显着提高，分别为92%、77%、78%、81%和86%。
由于早期检测是筛查试验的关键，研究人员进一步将注意力集中在BCLC 0和A期HCC上。分析表明，虽然尿液ctDNA检测对BCLC 0期的筛查敏感性较低，但所有样本的AFP均<20 ng/mL，因此两阶段模型可将敏感性提高到92%；同样，在BCLC A期中，两阶段模型敏感性从40%提高到77%。
最后，研究人员利用十倍交叉验证来检验模型预测的稳健性。结果表明，两阶段模型是稳健的，其AUROC从训练集0.912降至验证集0.902，且在90%特异性下，其敏感性仅损失1%，从79.6%降至78.6%，无显着差异。
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